免疫印迹（Western Blotting）的基本原理及应用
免疫印迹是一个用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下将电泳分离的蛋白从凝胶转移至一种固相支持物，然后利用抗原-抗体的特异性反应，从蛋白混合物中检测出目标蛋白，从而定量或定性的确定正常或实验条件下细胞或组织中目标蛋白的表达情况。Western blotting还可用于蛋白-蛋白、蛋白-DNA和蛋白-RNA相互作用的后续分析，作为一种廉价、便捷、可靠的研究工具，将与质谱和蛋白质芯片等技术一起在蛋白质组时代发挥重要作用。
Western Blotting的protocol种类繁多，但大同小异，基本为上述几个步骤。要得到一个完美的实验结果，不仅需要优质的抗体，同时应对整个实验流程和体系进行严格的质量控制，才能最终达到你的实验目的。
影响免疫印迹成败的一个主要因素是抗原分子中可被抗体识别的表位性质。因为涉及到抗原样品的变性，只有那些识别耐变性表位的抗体可以与抗原结合。多数多克隆抗体中或多或少含有这种类型的抗体，所以在免疫印迹中常选用多克隆抗体。第二个影响因素是蛋白原液中抗原的浓度。一些表达量低的蛋白在免疫印迹前常需要通过免疫沉淀，亚细胞分离等手段富集。
基本实验步骤
一、样品制备
对于Western Blotting实验而言，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白样品必须均质、可溶，并解离成单个多肽亚基，且尽量减少相互间的聚集，使其最终仅依赖本身的分子量大小进行分离。当目标蛋白的含量很低时，需要选取目标蛋白含量较高的组织或细胞器（如核抽提物），或者通过免疫沉淀等方式进行富集。通常样品有重组蛋白、细胞和组织等。
1.样品收集
1）培养的细胞
贴壁和悬浮细胞收集方式不同，细胞裂解液种类各异，推荐含SDS的凝胶加样缓冲液裂解，煮沸即可。
2）动物组织
与细胞不同，组织块由于体积较大，须预先经破碎匀浆处理。
2．样品定量
样品电泳前需测定蛋白浓度，以便保证上样量一致，有利于后续定量或半定量分析。常用的蛋白质浓度测定方法有好多种，其灵敏度和所需时间不同，且不同的方法会受不同干扰物质的影响，实验者可根据样品制备方法（裂解液成分、去垢剂和还原剂种类等）自行选择。
几种蛋白质浓度测定方法比较
| 优点 | 缺点 |
Bradford法 | 迅速、灵敏 | 对各种纯化蛋白质反应不同 |
BCA法 | 简单、干扰少 | 耗时 |
Lowry法 | 不同蛋白差别小 | 干扰多，较慢 |
注意事项：
· a. 应尽量避免引入影响后续定量的杂蛋白（如细胞培养液、蛋白酶抑制剂等）及其他干扰物质；
· b. 样品浓度应适中，1×SDS凝胶加样缓冲液建议用量：贴壁细胞按10cm2培养皿/0.1ml，悬浮细胞按5×106细胞/0.1ml比例加入；
· c. SDS对蛋白质变性和电泳分离至关重要，浓度应控制在2-10%之间，并根据具体需要调整；
· d. 制备好的样品可以在-20℃保存，但时间不宜过长，并避免反复冻融，否则蛋白会发生降解；
· e. 内参对实验结果至关重要，应选择合适的内参。
二、电泳
电泳分为非变形凝胶电泳和变性凝胶电泳，Western Blotting中常用的是不连续缓冲系统下的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），该法中由于变性的多肽与SDS结合而带负电荷，在凝胶电泳中迁移率仅与多肽的分子量相关。凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。
SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围
丙烯酰胺浓度（%） | 线性分离范围（KD） |
15 | 12-43 |
10 | 16-68 |
7.5 | 36-94 |
5.0 | 57-212 |
注意事项：
· a. 根据目标蛋白的分子量选择合适浓度的凝胶，以达到最优的分离效果和分辨率；
· b. 分离胶不宜灌注过满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果；
· c. 各泳道上样体积最好大体一致且适中，体积偏差过大会相互挤压导致条带走形，为避免边缘效应，可在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液；
· d. 电泳时应保持电压和电流稳定，且不宜过高，否则会造成不规则的蛋白质迁移带；
· e. 如有特殊需要，可以使用梯度胶，高浓度丙烯酰胺可以使低分子量蛋白质形成清晰的条带，还能在一块胶内同时分离分子量范围更大的蛋白质。
三、转膜
蛋白质经SDS-PAGE分离后，必须及时从凝胶中转移到固相支持物上，固相支持物能牢固结合蛋白又不影响其抗原活性，而且支持物本身还有免疫反应惰性，这使其比直接在凝胶上检测更易操作，试剂用量更少，更省时，效果更好。
蛋白质从凝胶向膜转移的过程普遍采用电转印法，分为半干式和湿式转印两种模式，与SDS结合的蛋白由于带有负电，在电场中向正极迁移，并最终结合在固相支持物上。两种方法均卓有成效，且各有所长，实验者可根据实验情况不同进行选择。
常用固相支持物
| 硝酸纤维素(NC)膜 | 尼龙膜 | 聚偏二氟乙烯(PVDF)膜 |
灵敏度和分辨率 | 高 | 高 | 高 |
背景 | 低 | 较高 | 低 |
结合能力 | 80-110 ug/cm2 | >400 ug/cm2 | 125-200 ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合） |
材料质地 | 干的NC膜易脆 | 软而结实 | 机械强度高 |
溶剂耐受性 | 无 | 无 | 有 |
操作程序 | 缓冲液润湿,避免气泡 | 缓冲液润湿 | 使用前100%甲醇润湿 |
检测方式 | 常规染色，可用于放射性和非放射性检测 | 不能用阴离子染料 | 常规染色，可用考马斯亮蓝染色，可用于ECL检测，快速免疫检测 |
适用范围 | 0.45um: 一般蛋白 0.2um: <20kD蛋白 | 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中) | 糖蛋白检测和蛋白质测序 |
价格 | 较便宜 | 便宜 | 较贵 |
注意事项
· a. 样品属性、膜类型、胶浓度以及转移缓冲液均会影响蛋白质的转移效率，比如小分子量蛋白与大分子量蛋白相比，迁移迅速，但结合不牢固；
· b. 蛋白与固相支持物结合的程度受多种因素影响，如膜属性（孔径和类型），缓冲液属性（pH值、盐离子种类、盐浓度、去垢剂等），如实验结果不佳，可分别进行优化；
· c. 如果转膜与电泳的缓冲液系统不同，转膜前应将凝胶在转膜缓冲液中平衡，防止凝胶膨胀或收缩，以保证条带清晰完整；
· d. 提高蛋白质转移效率的方法：转移缓冲液中加入甲醇或低浓度的SDS (0.02-0.1%)，使用小孔径膜，转移后立即用戊二醛交联；
· e. 转膜时间和电流大小可根据蛋白分子量大小灵活调整；
· f. 转移效果可通过染胶（考马斯亮蓝染色或银染）或染膜（丽春红S染色、印度墨汁染色）来鉴定。
四、封闭
在进行抗体杂交之前，需要采用异源性蛋白质先对转印膜进行封闭，防止免疫试剂的非特异性吸附，从而降低背景，增加灵敏度，提高信噪比。常用封闭物有脱脂奶粉和BSA（稀释于不同的缓冲液中），但不同的抗原-抗体反应，封闭条件均不相同，没有适合所有系统的封闭液，具体封闭条件（包括封闭液浓度、缓冲液种类、封闭时间、温度等）需自行优化。
注意事项
· a. 影响非特异性结合的因素很多，针对不同的免疫原，其封闭条件均可进行优化，没有通用的封闭液，因为每个抗原-抗体反应都具有独特的性质；
· b. 在选择封闭物时，最重要的标准是信噪比，封闭条件不足，会导致过多的背景噪音，封闭条件过度，会造成信号变弱；
· c. 可根据不同的检测系统（碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶）、蛋白质属性（分子量大小）选择适当的封闭物及缓冲液（PBS或TBS）。
五、杂交
封闭后，目标蛋白便与特异性的一抗进行免疫反应，一抗可以是标记的，也可以是非标记的。标记的一抗与免疫原结合后，可直接进行检测（直接法），降低了背景和非特异性结合，但信号较弱。非标记的一抗配合标记的二抗使用（间接法），对信号有级联放大作用，可以增加灵敏性和信噪比。二抗既可标记放射性同位素，也可标记染料或其他分子，或与酶偶联。常用的酶包括碱性磷酸酶（AP）和辣根过氧化物酶（HRP），通过与底物反应产生光信号。
注意事项
· a. 标记方法的选择视灵敏度和易操作性而定，通常有四种标记系统：化学发光、放射性同位素、荧光、化学荧光；
· b. 一般而言，一抗常用非标记的，但遇到特殊实验需要，可以对一抗进行相应标记；
· c. 单抗和多抗各有利弊，多抗便宜、制作省时、亲和力高，但特异性不佳；单抗特异性好、纯度高、重复性好，但制作工期长，价格较高；
· d. 一抗稀释比例及反应条件（温度、时间）视抗体效价而定，并需根据实验结果进行优化，二抗一般可固定一个反应条件（建议1：4000、室温1小时）；
· e. 清洗步骤对移除未结合试剂、降低背景、增加信噪比至关重要，清洗不够会造成较高背景，清洗过度会导致灵敏度降低，清洗液的成分可适当调整。
六、显色发光
根据二抗的标记物不同，其显色方法也不同，并通过胶片或影