免疫荧光（Immunofluorescence, IF）原理
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。
紫外光激发荧光物质放射荧光示意图
免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。
基本实验步骤：
（1）细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm，5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（2）固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5 min。
（3）通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3×5 min。
（4）封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。
（5）一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。
（6）二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。
（7）封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。
（一）细胞准备
用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好的细胞一般在培养时直接放入coverslips让细胞生长在其上即可，尽量避免使用贴壁性能不好的细胞进行免疫荧光实验，以免后续的漂洗操作引起细胞脱落。少数实验需要使用这类细胞或者悬浮细胞进行免疫荧光观察，建议使用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。
（二）固定和通透
除研究细胞表面抗原或不稳定抗原可不固定外，一般均应固定。固定的目的有三：
①防止细胞从玻片上脱落；
②除去防碍抗原-抗体结合的类脂；
③使标本易于保存。
标本的固定原则是：
①不能损伤细胞内的抗原；
②不能凝集蛋白质；
③应保持细胞和亚细胞结构；
④固定后应保持通透性，以保证抗体自由进入所有细胞与亚细胞组分与抗原结合。
常用的固定剂有多种，应根据所研究抗原的性质和所使用的抗体特性选择适当的固定剂。通常固定方法可以分为两类：有机溶剂和交联剂。有机溶剂如甲醇和丙酮等可去除类脂并使细胞脱水，同时将细胞结构蛋白沉淀。交联剂如多聚甲醛通常通过自由氨基酸基团形成分子间桥连，从而产生一种抗原相互连接的网络结构。交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但因为交联阻碍抗体结合，可能会降低一些细胞组分的抗原性，因此需要增加一个通透步骤以使抗体能够进入标本。两种固定方法都可能使蛋白抗原变性，因此使用变性蛋白作为抗原生产的抗体在免疫荧光中可能更为有效。
最常用的固定剂有多聚甲醛和甲醇，少数情况也使用乙醇，丙酮及戊二醛等进行固定。通常，细胞结构抗原、病毒及一些酶类抗原使用丙酮、乙醇及高浓度的甲醛固定可获得较好的结果，而细胞膜相关组分抗原一般以多聚甲醛固定。细胞器和细胞颗粒内的抗原一般也用多聚甲醛固定，并需要进行通透以使抗体能达到抗原表位。
通透步骤只在检测细胞内抗原表位的时候才需要，因为抗体需要进入细胞内部去检测蛋白。但是，如果待检测的是跨膜蛋白，且其抗原表位处于胞质内区域，则同样需要对细胞进行通透。相反，如果所检测的抗原表位位于膜蛋白的胞外段，则不需要进行通透。丙酮本身具有通透作用，因此用丙酮作为固定剂时是不需要通透的。甲醇同样具有通透作用，但有些场合并不适合用甲醇，因为一些表位对甲醇非常敏感。常用的通透剂是去垢剂，如Triton ，NP-40，以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40属于烈性去垢剂，可部分溶解细胞核膜，因此非常适合核抗原检测。但应该注意的是，如果在高浓度下使用或者作用时间过长，它们将破坏蛋白，从而影响实验结果。Triton X-100是最常用的通透剂，但是它将破坏细胞膜，因此不适用于细胞膜相关抗原。后面一组去垢剂要温和得多，它们可以在细胞质膜上形成足够大的孔隙以允许抗体通过，但是不会溶解细胞质膜。适于胞质抗原或者质膜上靠近胞质一面的抗原，也适于可溶性的核抗原。
一般的操作程序是先固定后通透，但针对有些水不溶性的目的抗原的检测宜先通透再固定，这样做的原因主要是可以通过通透去除许多水溶性的蛋白，从而大大减少了免疫荧光的背景和非特异性信号。固定后以冷PBS液漂洗，最后以蒸馏水冲洗，防止自发性荧光。
（三）封闭
封闭的目的是为了减少抗体的非特异性结合，最常用的封闭剂为1% BSA, PBS pH 7.5，其他可选择的封闭剂还有 1% gelatin, 1%bovine 或与二抗种属相同的血清（3-10%）等。
（四）抗体孵育
直接免疫荧光法中的一抗和间接免疫荧光法中的二抗都是荧光抗体，因此在这些抗体孵育的时候必须注意避光。此外，为保证结合质量和防止干燥，抗体孵育应尽量在湿盒中进行。
（五）封片及荧光观察
标记好荧光的细胞片原则上可以直接进行观察，特别是有时候封片不当反而使得前功尽弃。但在绝大多数情况下，为了保存结果，以便进一步观察、照像、统计分析等，需作封片处理。常规的方法是采用甘油或中性树脂封片，为了增强封片的效果，往往需要在封片时添加特殊的抗荧光淬灭剂。
（六）标本保存
由于荧光色素和蛋白质分子的稳定性都是相对的，因此随着保存时间的延长，在各种条件影响下，标记蛋白可能变性解离，失去其应有的亮度和特异性。因此给标本的保存带来一定的困难，所以在标本进行荧光染色之后应立即观察。由于性能良好的抗荧光淬灭剂的出现，荧光标记的标本可以在低温（4℃或-20℃）下保存相当长的时间。在某些情形下，考虑到实验的成本及实验条件，也可以采取权宜的办法，比如固定标本片后低温保存，在需要时再进行荧光标记，即随用随染
固定剂主要有两类：一类是有机溶剂，如甲醇、乙醇、丙酮等。它们通过强烈脱水变性蛋白，同时它们也能够溶解脂类物质，因此产生通透效应。另一类为交联剂，如甲醛、多聚甲醛、戊二醛等，它们导致细胞内分子相互连接成网状结构，从而维持在原位上。这两类固定剂各有优缺点，交联剂比有机溶剂更易于保持细胞的结构，但交联可能会破坏一些细胞组分的抗原性。同时交联剂固定的细胞需要通透处理，才能让抗体穿越膜结构与胞内抗原结合。醇类固定的优势在于蛋白变性完全，对抗原的保存性好，能充分暴露出抗原。醇类固定的细胞不需要再通透。
在免疫细胞(组织)化学实验中选择哪种固定方法，先要考虑所检测抗原在细胞中的定位，通常膜组分的蛋白需要用多聚甲醛固定。其他蛋白往往凭经验选择固定剂，可以试用两种方法，然后选择较好的一种。
设立对照的目的在于证明和肯定阳性结果的特异性，排除非特异性疑问，同时对照的设立也有助于判断实验中出现的问题。
（1）阴性对照
阴性对照可以了解背景荧光和非特异性染色，当待检标本呈阳性结果时，阴性对照就更加重要，用以排除假阳性。较理想的阴性对照检测遗传背景相同但仅仅不表达所研究抗原的细胞，例如把某个蛋白已敲除的细胞或动物组织样品。但这样的标本不一定存在或很难找到，常见的阴性对照也可以是针对一抗的PBS对照或来自同一种属动物的血清对照。
（2）阳性对照
用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色，这种阳性对照可验证Protocol，排除实验过程中出现的差错。另一种阳性对照可以是在细胞内过表达所研究的抗原。同时也可以在这个抗原上接上商业化的表达标签，如Flag, Myc, His tag等。
免疫荧光双标记（Double Immunofluorescence）是用两种不同荧光染料标记的抗体同时检测两种抗原。标记这两种抗体的荧光素具有不同的颜色（激发和发射波长不同），通过荧光显微镜可以在同一细胞上分别观察到两种抗原，并可通过图像处理软件将它们同时呈现在一张图片上。
由于在同一个样本使用两种染料，为此就要求每一种检测试剂仅能识别一种抗原。主要有两种方法能够达到这一目的。最确定的方法就是直接标记一抗，如其中一种标记FITC，另一种标记Texas红，一般会有满意的结果。第二种方法是应用两套种属特异性的检测试剂。在进行这类进行荧光双标前，最好先验证单标对特定组织或细胞是有效的。在操作上与单标方法并无不同，但两种一抗必须来源于不同种属的动物，且两种二抗不能存在交叉反应。
应该选择什么样的抗体进行免疫荧光及免疫细胞（组织）化学实验？
如果使用商业化的抗体，在使用之前要仔细阅读公司关于抗体的说明，该抗体是否能用来做免疫荧光或免疫细胞（组织）化学实验。对于自己生产的抗体，在生产抗体时选用的免疫原对获得高质量的试验结果非常重要。
其次，就是单抗和多抗的选择问题。这方面基本上遵循着通用的原则，多抗的优点是来源动物种属多，亲和力高，反应性广，可以识别抗原的多种亚型，缺点是特异性相对较差，有时容易带来假阳性结果，且抗体质量存在批次差异；单抗的最大优点是特异性好，质量稳定，但缺点是动物来源受限（绝大多数是小鼠），灵敏度较低，而且价格较高。单抗对固定的容忍度不如多抗，因为它们识别的位点比较单一，更容易受到破坏。
免疫荧光实验中用于标记抗体的荧光素有哪些，在选择上有什么考虑？
以下列举几种常用的荧光素，更多的荧光素可以从相关网站上找到：
1. FITC（Fluorescein） Excitation 495nm，Emission 525nm，黄绿色荧光；
2. Rhodamine (TRITC) Excitation 552nm，Emission 570nm，橙红色荧光；
3. R-Phycoerythrin (PE) Excitation 488nm，Emission 578nm，橙红色荧光；
4. Texas Red Excitation 596nm，Emission 620nm，红色荧光。
选择荧光素主要考虑以下几点：
①高消光系数（extinction coefficient）和光子产量（Quantum yield），这意味着光捕获能力强和效率高；
②光稳定性较好；
③与常见光源和滤光器匹配性较好；
④不干扰抗体反映；
⑤水溶性以及pH稳定性。此外，还需要考虑到是否有毒性以及荧光素的颜色是否与背景颜色反差大对比鲜明等。
免疫酶标细胞(组织)化学中有哪些显色液，它们的各自特性是什么？
免疫酶标细胞化学中，由于抗原-抗体反应所形成的复合物本身无色，无法直接观察，因而需借助于某些化学基团的呈色作用，使其得以显示，以利于在显微镜下观察。常用的显色液有：
1．DAB（Diaminobenzidine；3，3-二氨基苯联胺）显色液
DAB显色液主要用于免疫过氧化物酶法（如酶标法、PAP法等），是广泛应用的电子供体之一，较敏感，切片可脱水透明，半永久保存，且其终产物具嗜饿性，既可直接在光镜下观察，也可经OsO4处理后，增加反应产物的电子密度，适于电镜下确定抗原存在的部位。但有几点需注意：DAB溶解要完全，否则未溶解的颗粒沉积于标本上影响观察；DAB浓度不易过高，否则显色液呈棕色，增加背景染色，另外DAB有致癌作用，应尽量减少吸入和接触次数，最好将DAB制成10倍贮存液，分装于-20℃保存，应用时稀释、过滤。操作时应戴手套，尽量避免与皮肤接触，用后及时彻底冲洗，接触DAB的实验用品最好经洗液浸泡24h后使用。
2．CN（4-Cl-1-Naphthol，4-氯-1-萘酚）显色液
4-Cl-1-萘酚的终产物显示蓝色。由于酒精可溶解4-Cl-1-萘酚显色的组织标本，勿用酒精脱水。与DAB比较，CN敏感性略差，但因其终产物较局限，很少弥散，光镜观察较为适合。
3．AEC（3-amino-9-ethyl-carbozole, 3-氨基-9-